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N-terminale Proteinsequenzierung - Edman Abbau

Technische Begrenzungen des Edman Abbaus

http://www.biomodul.de/edman.html

Edman Abbau 

Peptide und Proteine mit blockierten N-terminalen Aminogruppen, unterliegen nicht dem Edman-Abbau. Es muß eine freie Aminogruppe an der N-terminalen AS vorliegen. Das bedeutet natürlicherweise acetylierte, formylierte oder andere N-terminal blockierte Proteine ergeben kein Ergebnis im Edman-Abbau („dauerhaft Blank“).

Hochmolekulare Proteine über 75 kDa können sich in der Analyse als schwierig erweisen. Unseren Erfahrungen nach ist zumeist eine zu geringe Probenmenge und /oder eine mangelhafte Reinheit der Proben Grund dafür. Bei gut präparierten Proteinen, in ausreichender Menge, sind auch in diesem Bereich >75 kDa gute und eindeutige Ergebnisse im Edman-Abbau zu erhalten.

Unmodifizierte Cysteine und glykosylierte Aminosäuren ergeben im Edman-Abbau einen “Blank-Zyklus”, d.h. bei diesem einen Zyklus kann keine entsprechende UV-Absorption detektiert werden. Die entsprechende Aminosäure wurde zwar von der Peptidkette entfernt, kann aber nicht bei UV = 270 nm detektiert werden. Die nachfolgenden Aminosäuren sind dann in der Regel wieder sichtbar. Es sei denn ---!

Proteinsequenzierung





Die Probenqualität ist kritisch für den Erfolg einer Proteinsequenzierung. Jede Verunreinigung, die mit dem Edman’s Reagenz wechselwirken kann, insbesondere aber Chemikalien die Amin-Gruppen enthalten (Tris / Glycin : Lämmli-Puffer) oder andere die Probe verunreinigenden Proteine (z.B. Casein, Molekulargewichtsmarker) führen zu unbefriedigenden Ergebnissen.

Aufgrund der technischen Konstruktion eines Sequenziergerätes und der dabei verwendeten Reagenzien, muß die Proteinprobe verschiedene Voraussetzungen erfüllen:
  1. Sie muß frei von SDS sein, ansonsten verstopfen die Kanäle des Sequenziergerätes.
  2. Die Protein-Probe muß möglichst konzentriert auf eine Fläche von 3 mm x 6 mm geblottet werden, eine große Menge an Probe verteilt auf eine größere Fläche ist sinnlos, da nur die Fläche von 3 mm x 6 mm im Gerät eluiert und analysiert wird. Es können jedoch mehrere kleine Proteinmengen auf eine PVDF Membran entsprechender Größe gepoolt werden (dies übernehmen wir für Sie). 
  3. Die Protein-Probe muß auf eine PVDF-Membran geblottet bzw. aufgetragen werden, nur PVDF widersteht den während der Sequenzierung verwendeten Reagenzien. Die herkömmlichen Nylon-Membranen zersetzen sich und führen so zur Beschädigung des Sequenziergerätes. 


LF


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• Project report

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